PKC活性检测试验

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所属分类:固含量检测仪
电泳仪(北京六一厂,112-0640);水平电泳槽(北京六一厂,122-3146);电热恒温培养箱(碧云天生物,EBI025);电热恒温水浴锅(江苏省金坛市环宇科学仪器厂,HH-8) 基本原理:分离
PKC活性检测试验

PKC活性检测试验

  电泳仪(北京六一厂,112-0640);水平电泳槽(北京六一厂,122-3146);电热恒温培养箱(碧云天生物,EBI025);电热恒温水浴锅(江苏省金坛市环宇科学仪器厂,HH-8)

  基本原理:分离PKC蛋白(磷酸化蛋白及非磷酸化蛋白),利用试剂盒组分将2种蛋白分离并加以区分,利用电泳琼脂糖凝胶技术显示2种不同的蛋白,利用分析软件将显示的不同蛋白定量并加以比较,以磷酸化PKC非磷酸化PKC灰度值IOD的比值显示PKC活性(PKC活化度)。

  3.用PKC 抽提液预平衡1ml 的DEAE 纤维素柱,再把第2 步中得到的上清过柱。用5ml的PKC 抽提液洗柱子,然后用5ml 含有200mM NaCl 的PKC 抽提液洗脱含有PKC 的组分。

  6.对每一个样品,按照下面所列顺序在0.5ml 小离心管中混合PepTag® PKC 5× Buffer,PepTag® C1 Peptide,超声过的PKC Activator 5X Solution,和水。在样品加入之前,小离心管一直要放在冰上。阴性对照将用于对反应进行定量时确定其摩尔吸收值(说明书第IV.部分)。

  7.在0 时间点,把一支管子从冰上移到30℃水浴中孵育2 分钟。然后加入样品或蛋白激酶C 在30℃ 再孵育30 分钟。

  8.把管子放进开水浴或95℃ 加热块10 分钟以终止反应。在凝胶电泳前把样品一直避光存放在4℃ 或-20℃。

  9.把样品上样到胶上之前,往每个样品中加进1ul 的80%甘油,以确保样品保留在上样孔中(说明书第III.F 部分)。

  10.每孔点样10ul,在0.8% 琼脂糖凝胶上以100V电泳15分钟分开样品,拍照。

  说明:后面2组泳道“阳性(PC)”和“阴性(NC)”为试剂盒自带系统对照。

  注:阳性条带以Gel pro4 版凝胶光密度分析软件进行分析,测其IOD(integrated optical density)累积光密度参考值。按照百分比例计算PKC活性百分比

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